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　　目前皮膚致敏性試驗方法有：豚鼠最大劑量法(GPMT)、封閉式貼敷法(Buehler試驗)、局部淋巴結試驗法(LLNA)，其中豚鼠最大劑量法(GPMT)和封閉式貼敷法(Buehler試驗）是最常用的、生物安全性評價中使用率最高的兩種方法。

 

　　豚鼠最大劑量試驗是最敏感的方法，歐洲國家使用此方法較廣泛；封閉式貼敷試驗適用于局部產品，美國常用此方法。局部淋巴結試驗(LLNA）被經濟與合作發展組織接受作為當前豚鼠試驗的唯一替代方法，該法對動物保護方面也有所改善，也被認可用于化學物致敏活性的檢測。

 

 

　　原理：過敏劑可誘導引起作用位點的引流淋巴結內淋巴細胞增殖，其增殖程度與過敏劑的劑量和致敏效力成正比。從而提供了一種簡單的獲取定量測量致敏性的方法。BrdU是胸腺咤啶核苷的類似物并可摻入增殖細胞的DNA中。

 

　　通過酶聯免疫吸附試驗方法測量試驗動物耳部引流淋巴結內摻入BrdU的量來指示增殖細胞的數量增加，并用試驗組與對照組的平均增殖量之比(SI)來評價增殖情況，確定待測物質的致敏潛能。

 

　　動物管理：成年未生育過且未受孕的雌性小鼠，8周齡~12周齡，動物體重不超過平均體重的±20%。

 

　　試驗樣品：應為液體、懸浮液、凝膠或膏狀物，此類樣品可應用小鼠的耳部。

 

　　試驗設置：設置一個或多個對照組、一個陰性對照組和一個陽性對照組；每組至少使用4只動物。經常進行LLNA時不必每次試驗都包括陽性對照，但至少每6個月應采用一次陽性對照。

 

　　試驗步驟：LLNA檢驗化學物一般采用劑量反應方式，醫療器械供試樣品可能為浸提液，此時僅有單劑量用于試驗，一般可檢驗未稀釋的浸提液。當浸提液含有高毒性成分時，毒性在LLNA中可導致陰性反應。因此在LLNA中檢驗高毒性浸提液時，推薦采用劑量反應方式和稀釋浸提液。

 

　　在試驗開始和結束時應記錄每只動物體重，將適宜的樣品應用于指定小鼠雙耳的背側，劑量為25uL/d，連續3天。為了檢驗試驗樣品的潛在毒性，試驗中應每天觀察雙耳可能會干擾結果解釋的刺激跡象并記錄觀察結果，通過測定每只動物或匯集的淋巴結樣品來確定淋巴結反應。

 

　　結果與評價：測定每只小鼠每分鐘淋巴結細胞計數(cpm)的放射活性水平。試驗cpm除以空白cpm得出刺激指數(SI)，試驗樣品SI≥3.0，考慮陽性，為致敏物。陽性對照樣品SI應≥3.0。

 

 

　　原理：單一化學物采用豚鼠最大劑量試驗，對材料在試驗條件下使豚鼠產生皮膚致敏反應的潛能做出評定。

 

　　動物與管理：使用健康、初成年的豚鼠，試驗開始時體重應為300g~500g，雌雄不限，雌鼠應未產并無孕。

 

　　試驗材料若為粉末或液體，至少使用10只動物接觸試驗樣品，至少使用5只動物作為對照組。

 

　　對于浸提液試驗，至少使用10只動物接觸試驗樣品，至少使用5只動物作為溶劑對照組。

 

 

　　皮內誘導階段

 

　　1——頭端；

 

　　2——0.1mL皮內注射點；

 

　　3——去毛的肩胛骨內側部位；

 

　　4——尾端。

 

　　按上圖在每只動物去毛的肩胛骨內側部位成對皮內注射0.1mL。

 

　　A部位：注射FCA與選定的溶劑以50：50體積比混合的穩定性乳化劑，對于水溶性材料，溶劑選用生理鹽水。

 

　　B部位：注射試驗樣品即未經稀釋的浸提液；對照組動物僅注射相應溶劑。

 

　　C部位：試驗樣品以50：50的體積比例與弗氏完全佐劑和溶劑(50%）配置成的乳化劑混合后進行皮內注射；對照組注射空白液與佐劑配成的乳化劑。

 

　　局部誘導階段：皮內誘導階段后6~8天，按部位B中選定的濃度，采用面積約8cm2的濾紙或吸水性紗布塊局部貼敷于每只動物的肩胛骨內側部位，覆蓋誘導注射點。如按皮內誘導階段的最大濃度未產生刺激反應，應在局部敷貼應用前22~26h，試驗區用10%十二烷基硫酸鈉進行預處理，按摩導入皮膚。用封閉式包扎帶固定敷貼片，并于46~58h后除去包扎帶和敷貼片。對照組動物使用空白液同法操作。

 

　　激發階段：局部誘導階段后13~15d后，用試驗樣品激發全部試驗動物和對照動物。按C部位選定的濃度將適宜的敷貼片置于試驗樣品或介質對照中浸透，局部敷貼于誘導階段未試驗部位。該濃度的稀釋液可同法敷貼于其他未試驗部位。用封閉式包扎帶固定，并于22~26h后除去包扎帶和敷貼片。

 

 

　　除去敷貼片后(24士2)h和(48±2)h觀察試驗組和對照組動物激發部位皮膚情況，在自然光或全光譜光線下觀察皮膚反應。按Magnusson和Kligman分級標準，對照動物分級小于1，試驗組中分級大于或等于1時，一般提示致敏。如對照動物分級大于或等于1時，試驗超過組動物反應對照組中最嚴重的反應則認為致敏。

 

　　如疑似反應，進行再激發以確認首次激發結果，試驗結果顯示為試驗和對照動物中的陽性激發結果的發生率。如試驗組動物出現反應的動物數多于對照組動物，但反應強度并不超過對照組，可能需要在首次激發后1周~2周進行再次激發，以明確反應。所用方法與首次激發相同，采用動物未試驗的一側部位。

 

 

　　試驗樣品：按標準規定的方法進行樣品制備，在不影響結果解釋的情況下，試驗樣品濃度應盡可能的高，試驗樣品的性狀和尺寸適宜，局部應用器械可原樣敷貼。

 

　　動物管理：使用健康、初成年的豚鼠，試驗開始時體重應為300g~500g，雌雄不限，如雌鼠應未產并無孕。

 

　　試驗材料若為粉末或液體，至少使用10只動物接觸試驗樣品，至少使用5只動物作為對照組。對于浸提液試驗，至少使用10只動物接觸試驗樣品，至少使用5只動物作為溶劑對照組。

 

 

　　誘導階段：按選定的試驗樣品濃度，將合適的敷貼片浸透試驗樣品，局部敷貼于每只動物的左上背部位。(6±0.5)h后除去任何封閉式包扎帶類的固定物和敷貼片。1周中連續3d重復該步驟，同法操作3周，對照組動物僅使用空白液同法操作。

 

　　激發階段：最后一次誘導敷貼后(14±1)d用試驗樣品對全部試驗動物和對照動物進行激發，按選定的試驗樣品濃度將合適的敷貼片浸透試驗樣品單獨局部貼敷于每只動物去毛的未試部位。(6±0.5)h后除去固定物、封閉包扎帶和敷貼片。

 

 

　　首次激發或再次激發接觸后(24±2)h，用市售脫毛劑給動物脫毛，將脫毛劑涂到試驗和周圍部位；或剃去激發部位及周圍部位的動物被毛。

 

　　用溫水徹底清洗脫毛區，并用毛巾擦干動物后放回籠中。脫毛后至少2h，對試驗部位評分，并在除去激發貼片后(48±2)h再進行評分。

 

　　按Magnusson和Kligman分級標準，對照動物分級小于1，而試驗組中分級大于或等于1時，一般提示致敏。如對照動物分級大于或等于1時，試驗超過組動物反應對照組中最嚴重的反應則認為致敏。如為疑似反應，進行再激發以確認首次激發結果，試驗結果顯示為試驗和對照動物中的陽性激發結果的發生率。如試驗組動物出現反應的動物數多于對照組動物，但反應強度并不超過對照組，可能需要在首次激發后1周~2周進行再次激發，以明確反應。所用方法與首次激發相同，采用動物未試驗的—側部位。

 

　　以上大致介紹了三種皮膚致敏試驗方法，豚鼠最大劑量法和封閉式貼敷法應用廣泛；局部淋巴結試驗不包括激發階段，試驗所關注的終點是刺激指數(SI)，該試驗周期較短，結果客觀敏感，所用試驗材料較少，并且免除了弗氏完全佐劑注射。

 

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